Биоселективные макромолекулярные системы антибактериального и противовирусного действия на основе сульфатпроизводных полисахаридов

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. В мире по борьбе с инфекционными заболеваниями образование быстрой и легкой устойчивости (резистентности) патогенов против низкомолекулярных биологически активных веществ является одной из актуальных проблем. В настоящее время развитие экспериментальных методов биоорганической химии, биохимии, микробиологии дало возможность рассмотреть на молекулярном уровне действия лекарственных препаратов на патогенные микробы, вирусы и раскрыть механизмы проявления эффективной биологической активности. После обретения независимости в республике особое внимание уделяется защите населения от инфекционных заболеваний, их профилактике. В данном направлении на основе предпринятых запланированных мероприятий получены определенные результаты, в частности достигнуты основанные на современных подходах результаты по разработке высокоэффективных, импортозаменяющих антибактериальных и антивирусных препаратов. В последние годы появился ряд сообщений о роли протеогликанов в ингибировании бактерий и вирусов, которые дали возможность создания препаратов нового поколения, проявляющие свойства, ингибирующие активность патогенов (микробов), на основе полианионных природных полисахаридов с протеогликаноподобной структурой, в частности гликозаминогликанов. Конкретные задачи для дальнейшего развития фармацевтической промышленности, а также обеспечения населения и медицинских учреждений дешевыми высококачественными лекарствами и медицинскими изделиями, поставленные в Стратегии действий по дальнейшему развитию Республики Узбекистан, послужат руководством в реализации данной работы. В настоящее время в мире создание протеогликаноподобной структуры на основе полисахаридов и их полианионных производных (сульфатированных, фосфорилированных и т.д.), комплементарно блокирующих гликопротеин патогена, позволит создать макромолекулярные системы антибактериального и противовирусного действия и разработать нерезистетнтные к патогенам лекарственные препараты. Актуальность и востребованность результатов диссертационной работы заключается в создании вышеназванных макромолекулярных систем, в установлении взаимосвязи структуры полианионных полисахаридов с их антимикробной и противовирусной активностью, позволяющих создать протеогликаноподобные полисахаридные структуры, комплементарно взаимодействующие с рецепторами (гликопротеинами) патогена, что приводит к их блокированию в инфицировании здоровой клетки организма. Данное диссертационное исследование в определенной степени послужит выполнению задач, предусмотренных в Постановлении Президента Республики Узбекистан от 14 июля 2006 г № ПП-416 «О мерах по поддержке отечественных производителей лекарственных средств и изделий медицинского назначения», Указе Президента Республики Узбекистан от 7 февраля 2017 г № У П-4947 «О стратегии действий по дальнейшему развитию Республики Узбекистан», а также в других нормативно-правовых документациях, принятых в данной сфере. Целью исследования является целенаправленный синтез модифицированных полисахаридов, содержащих заместители анионной природы (сульфатные, фосфатные и карбоксильные), комплементарно взаимодействующих со специфическими рецепторами патогенов, создание терапевтических систем направленного антибактериального и противовирусного действий, а также определение их биологической функции. Научная новизна диссертационного исследования заключается в следующем: разработаны методы, позволяющие получить сульфатпроизводные полисахаридов с молекулярной массой (ММ) 10,5-120,4 кДа и степенью замещения (СЗ) от 0,30-2,92, фосфатпроизводные с ММ 6,2-72 кДа и СЗ 0,15-2,45, с равномерным распределением вдоль цепи макромолекулы замещенных групп, а также обоснована потенциальная возможность создания антибактериальных и антивирусных лекарственных препаратов на их основе; установлено влияние молекулярной массы макромолекулы анионпроизводных полисахаридов, содержания сульфатных, фосфатных, карбоксильных групп вдоль макромолекулы, конформации макромолекулы, расположения замещенных групп в ангидрогексозном звене на бактерицидную и вирулицидную активности; установлена зависимость чувствительности патогенных бактерий от природы и молекулярных параметров модифицированных полисахаридов, с увеличением СЗ образцов увеличивается антибактериальная активность, но резкое увеличение активности наблюдается при СЗ от 1,9 до 2,1, более выраженным антимикробным действием обладают сульфатированные р-гексозаны (целлюлоза, галактоманнан), по сравнению с сульфатированными а-гексозанами (амилоза, полигалактуроновая кислота, декстран); установлено, что анионпроизводные полисахаридов являются потенциальными объектами для создания препаратов против лейкемии, гепатита С и ВИЧ и доказано, что противовирусная активность против вируса лейкемии находится в пределе 0,02-0,45 мкг/мл при концентрации полумаксимального ингибирования (IC50), с увеличением СЗ возрастает противовирусная активность образцов, наиболее выраженной противовирусной активностью обладают сульфатированные единицы с р-структурами по сравнению с «-структурами; синтезированы анионпроизводные полисахаридов, обладающие наименьшей антикоагулирующей активностью. Последнее достигнуто синтезом сульфатированных полисахаридов, которые содержат сульфатные группы во 2 и 6 углеродных атомах ангидрогексозного звена; впервые методом компьютерного моделирования доказано действие анионпроизводных полисахаридов на рецепторные участки патогенов, приводящих к ингибированию их действия на здоровые клетки организма, между модельными структурами гликопротеинов мультирезистентных бактерий (Р. вирусов (гепатит моносахаридами полисахаридами С, лейкемия, (гексозы), установлена что доказано в ВИЧ-1) и а также возможность эксперименте в Aeruginosa, E.coli), сульфатированными модифицированными образования интерполимерных комплексов, условиях in vitro и in vivo. Выводы 1. Разработаны методы выделения и очистки полисахаридов: целлюлозы, пектина, галактоманнана. Определены физико-химические свойства полученных полисахаридов: молекулярная масса, конформационные особенности (природа химической связи основной макромолекулярной цепи), содержание функциональных групп (карбоксильные в пектине, галактоза в галактоманнане). Проведено гидролитическое расщепление основной и боковой цепи галактоманнана химическим и ферментативным (фермент а-галактозидаза) гидролизом. Установлено соотношение галактоза:манноза у исходного и гидролизованного галактоманнанов, которое равно 1:2,8 и 1:5, соответственно, что свидетельствует о преимущественном протекании гидролиза по боковой цепи макромолекулы. 2. Впервые систематически исследована химическая модификация (сульфатирование, фосфатирование) полисахаридов (целлюлоза, пектин, амилоза, галактоманнан), подробно определены их структура, молекулярные параметры и физико-химические свойства. Разработаны методы гомогенного сульфатирования полисахаридов с равномерным распределением степеней замещения. Получены сульфатпроизводные полисахаридов (целлюлозы, полигалактуроновой кислоты, галактоманнана) с ММ 10,5- 120,4 кДа (10,5-120,4 кДа, 12,6 -67,3 кДа, 13,1-125 кДа, соответственно) и СЗ от 0,30-2,92, имеющие почти одинаковое содержание сульфатных групп в ангидрогексозном звене, фосфатпроизводные с ММ 6,2-72 кДа и СЗ 0,15-2,45. Оптимизированы условия синтеза модифицированных полисахаридов с использованием метода автоматического непрерывного онлайн контроля реакций полимеризации (АСОМР), что позволило обеспечить непрерывный контроль и оценку кинетики реакции и за счет этого провести целенаправленный синтез. 3. Исследованием реакции сульфатирования полисахаридов впервые установлена реакционная активность гидроксильных групп в ангидрогексозном звене, которая уменьшается в ряду С-6>С-2>С-3. Установлено, что сульфатпроизводные полисахаридов в водных растворах обладают полугибкой конформацией, гибкость цепи увеличивается с увеличением СЗ образцов. 4. Впервые методом компьютерного моделирования установлено действие анионпроизводных полисахаридов на рецепторные участки патогенов, приводящих к ингибированию их действия на здоровые клетки организма, что подтверждено в эксперименте в условиях in vitro и in vivo. Между модельными структурами гликопротеинов мультирезистентных бактерий (Р. Aeruginosa, E.coli), вирусов (гепатит С, лейкемия, ВИЧ-1) и сульфатированными моносахаридами (гексозы), а также модифицированными полисахаридами доказано образование интерполимерных комплексов. 5. Впервые установлено, что чувствительность патогенных бактерий зависит от природы и молекулярных параметров модифицированных полисахаридов. Показано, что с увеличением СЗ образцов увеличивается антибактериальная активность, резкое увеличение активности наблюдается при СЗ от 1,9 до 2,1. Более выраженным антимикробным действием обладают сульфатированные р-гексозаны (целлюлоза, галактоманнан), по сравнению с сульфатированными а-гексозанами (амилоза, полигалактуроновая кислота, декстран). При низких концентрациях С-2,6-дисульфат полисахариды активно действуют на E.coli, Р. aeruginosa, S. aureus-, 6. Анионпроизводные полисахариды рекомендованы в качестве потенциального объекта для создания препаратов против вирусов лейкемии, гепатита С и ВИЧ. Показано, что противовирусная активность против вируса лейкемии находится в пределе 0,02-0,45 мкг/мл при концентрации полумаксимального ингибирования (1С5()), с увеличением СЗ возрастает противовирусная активность образцов, наиболее выраженной противовирусной активностью обладают сульфатированные единицы с р-структурами по сравнению с «-структурами;. 7. Синтезированы анионпроизводные полисахаридов, обладающие наименьшей антикоагулирующей активностью. Последнее достигнуто синтезом сульфатированных полисахаридов, которые содержат сульфатные группы во 2 и 6 углеродных атомах ангидрогексозного звена. Получены образцы с содержанием сульфатных групп во 2 и 6 углеродных атомов ангидрогексозного звена, по эффективности не уступающие гепарину и обладающие наибольшей активностью. Установлено, что Лд5о во всех препаратах составила >2000 мг/кг для мышей, >4000 мг/кг для крыс, модифицированные полисахариды являются малотоксичными соединениями. 8. Впервые получен гель «Бактоцел», содержащий сульфатированный полисахарид, показано, что он обладает ранозаживляющим действием, на 6-12 дней сокращает время очищения и заживления инфицированных ран. Сравнительным анализом действия с мазью «Левомеколь» определено, что наибольшее антибактериальное против стафилококка (S. aureus) и ранозаживляющее действие проявляется у геля «Бактоцел», даны рекомендации для разработки нового поколения антибактериальных средств; 9. Проведены доклинические испытания субстанции трисульфата целлюлозы и лекформы «Сульфогель». Определены физико-химические и биологические свойства сульфат целлюлозы (антимикробные, противовирусные свойства, токсичность, антикоагулянтная активность в условиях in vitro и in vivo), разработаны методы стандартизации субстанции и готовых лекарственных форм. Установлено, что трисульфат целлюлозы обладает наибольшей антикоагулянтной активностью, увеличивает время свертывания крови в 3-15 раз. Изучена антикоагулянтная активность «Сульфогеля» в сравнении с гепариновой мазью, рекомендована разработка мягкой лекарственной формы на гелевой основе «Сульфогель».