Пробиотические и бактериоциногенные свойства лактобацилл, создание на их основе противоязвенного средства

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. Длительное и часто бесконтрольное применение антибиотиков в медицине, ветеринарии и животноводстве привело к широкому распространению множественной лекарственной резистентности среди бактериальных патогенов человека и животных во всем мире. Снижение и зачастую отсутствие эффективности антибиотиков при терапии инфекционных заболеваний, возбудителями которых наиболее часто являются патогенные бактерии семейств Enterobacteriaceae, Staphylococcaceae, Pseudomonaceae, Listeriaceae привело к необходимости поиска и внедрения в медицинскую практику новых антимикробных соединений. В связи с этим, одной из актуальных задач фармацевтики и ветеринарии является поиск бактериоциногенных микроорганизмов и разработка новых технологий производства препаратов на их основе. В качестве альтернативы антибиотикам в настоящее время во всем мире исследователи рассматривают такие агенты как бактериофаги и их ферменты, пептиды эукариотических и прокариотических клеток и др. В этом же ряду находятся и пробиотики, состоящие только из естественных, физиологичных для человека и животных полезных микроорганизмов. Низкомолекулярные антимикробные пептиды - бактериоцины, отличаются от других (молочная, уксусная кислоты, перекись водорода) метаболитов специфичностью антимикробного действия и высокой бактерицидной активностью к патогенным микроорганизмам. Поэтому исследования, касающиеся выделения молочнокислых бактерий - продуцентов бактериоциноподобных веществ, изучение и оптимизация процессов образования бактериоцинов будет способствовать созданию новых антимикробных средств, отличающихся высокой терапевтической активностью, не обладающих побочными действиями и не вызывающих резистентность чувствительных микроорганизмов. Со времени приобретения независимости нашей республики в целях развития фармацевтической промышленности проведены широкомасштабные реформы. В результате проведенных программных мероприятий в данном направлении достигнуты определенные результаты, в том числе было создано новое научно-практическое направление - создание пробиотических препаратов на основе местных штаммов микроорганизмов, разработка способов их применения в клинической практике для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, особенно диарейных. Однако, не было уделено достаточно внимания исследованиям, направленным на изучение бактериоциногенных пробиотических штаммов микроорганизмов. В мерах по кардинальному совершенствованию системы управления фармацевтической отраслью1 обозначены задачи по «организации проведения научно-исследовательских работ для дальнейшего внедрения инновационных технологий в процессы производства лекарственных средств и выработке предложений по насыщению внутреннего рынка и локализации производства лекарственных средств». Исходя из поставленных задач, исследования, направленные на выделение новых местных штаммов мезофильных и термофильных лактобацилл, изучение их бактериоциногенных свойств, разработку противоязвенного пробиотического препарата на основе бактериоциногенных штаммов лактобацилл имеют важное научно-практическое значение. Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных ПП416 от 14 июля 2006 года Президента Республики Узбекистан «О мерах по поддержке отечественных производителей лекарственных средств и изделий медицинского назначения», УП5229 от 7 ноября 2017 года «О мерах по кардинальному совершенствованию системы управления фармацевтической отраслью», а также другими нормативно-правовыми документами, принятыми в данной сфере. Целью исследования является выявление потенциала лактобацилл как эффективных продуцентов бактериоцинов для разработки новых пробиотических препаратов. Научная новизна исследования заключается в следующем: впервые доказаны бактериоциногенные свойства местных штаммов мезофильных лактобацилл L. plantarum, L. paracasei, L. rhamnosus и термофильных - L. helveticus, L. delbrueckiisp. bulgaricus, L. amylovorus, выделенных из молочных продуктов и ферментированных растительных субстратов; идентифицированы мезофильные и термофильные лактобациллы по морфолого-культуральным, физиолого-биохимическим и генетическим признакам; впервые определен оптимальный состав питательных сред и условия выращивания для увеличения бактериоциногенной активности молочнокислых бактерий и достигнуто повышение образования бактериоцинов более чем в 2.6 - 4 раза по сравнению с контролем; установлено соответствие бактериоциногенных лактобацилл критериям, указанным в методической рекомендации МУК 4.2.2602-10 по пробиотическим свойствам: устойчивость к желчи и симулированному желудочному соку, кислым значениям pH, высокая антимикробная активность, адгезивность к клеткам кишечника; впервые раскрыто in vivo взаимодействие бактериоцин синтезирующего штамма Lactobacillus rhamnosus 925ак с чувствительным патогеном Helicobacter pylori на моделях стерильных и беспатогенных мышей и определено эффективное снижение колонизации хеликобактером желудка инфицированных мышей и снижение уровня воспаления при введении Lactobacillus rhamnosus 925ак. Выводы В результате исследований, проведенных в рамках докторской диссертационной работы «Пробиотические и бактериоциногенные свойства лактобацилл, создание на их основе противоязвенного средства» представлены следующие выводы: 1. Впервые проведен скрининг бактериоциногенных свойств штаммов лактобацилл, выделенных из местных природных источников и идентифицированы 6 штаммов -L. plantarum (3 штамма), L. helveticus, L. delbrueckii и L. amylovorus, синтезирующих бактериоцины, спектр антимикробной активности которых включает Ent. faecalis, Ent. faecium, List, monocytogenes, Pr. morganii, S. aureus , Ps. aeruginosa, Ser. marcescens и H. pylori. 2. Изучение соответствия штаммов лактобацилл критериям пробиотических культур выявило перспективные для использования в качестве пробиотиков новые штаммы L. rhamnosus 925ак и L. plantarum 42. 3. Подобран состав новой модифицированной питательной МРС среды на основе МРС с исключением из состава твина-80 и ацетата натрия, рекомендуемой для скрининга антимикробной и бактериоциногенной активности лактобацилл методом пятен на агаре. 4. При использовании различных вариаций источников азота и углеводов подобраны питательные среды, где единственным источником углевода для L. plantarum 42 является манноза и для L. plantarum К-2 в качестве источника азота используется триптон, позволяющие увеличить синтез бактериоцинов в 2.6 - 4 раза. 5. Отработана схема количественного определения Н. pylori в желудке животных, которая заключается в подсчете количества glmM гена в образце по отношению к стандартной кривой, построенной при амплификации рекомбинантных штаммов Е. coli с трансформированным целевым геном. 6. Впервые показана способность L. rhamnosus 925ак к эрадикации Н. pylori SS1 в желудке на гнотобиотических моделях мышей при превентивном однократном введении. 7. Показано, что как бактериоциногенные, так и небактериоциногенные L. rhamnosus способны устранять воспалительные процессы в слизистой оболочке желудка инфицированных хеликобактером специальных беспатогенных мышей. Установлено, что превентивное введение лактобацилл мышам эффективнее и в более короткие сроки снижает колонизацию Н. pylori SS1 по сравнению с постинфекционным введением. 8. Сравнительное изучение эффективности использования молочнокислых бактерий в комбинации с экстрактом прополиса для лечения экспериментальных язв позволило подобрать состав нового препарата, который состоит из ассоциации микроорганизмов Lactobacillus rhamnosus 925ак, Propionibacterium aviduml в соотношении 3:1 с добавлением 1% сухого спиртового экстракта прополиса.