РЕКОМБИНАЗНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ АМПЛИФИКАЦИЯ: МЕТОДОЛОГИЯ, МЕХАНИЗМЫ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

Аннотация

Рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA) представляет собой инновационную методику амплификации нуклеиновых кислот, которая сочетает в себе высокую чувствительность, скорость и возможность работы при постоянной температуре. Данная статья рассматривает основные принципы и механизмы действия RPA, включая ключевые компоненты реакции, такие как рекомбиназы, белки связывания одноцепочечных ДНК (SSB) и полимеразы. Также подробно изучаются биохимические основы метода, его преимущества и недостатки по сравнению с традиционной полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Особое внимание уделено применению RPA в молекулярной диагностике, включая диагностику инфекционных заболеваний, выявление генетических мутаций и тестирование на устойчивость вирусов к антивирусным препаратам. RPA демонстрирует высокий потенциал для использования в клинической практике, обеспечивая точную диагностику и ускоренную обработку результатов. В заключение обсуждаются перспективы дальнейшего развития технологии и её роли в современной медицине. Ключевые слова: рекомбиназная полимеразная амплификация, нуклеиновые кислоты, молекулярная диагностика, генетические мутации, ПЦР, инфекционные заболевания, амплификация, полимеразы, рекомбиназы, изотермическая амплификация. Введение. Современные достижения в области молекулярной биологии и медицины требуют разработки эффективных и доступных методов для амплификации нуклеиновых кислот, которые обладают высокой Выпуск журнала №-18 Часть–4_ Январь –2025 20 MODERN EDUCATION AND DEVELOPMENT чувствительностью, специфичностью и оперативностью. Одним из таких методов является рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA), который представляет собой инновационную изотермическую технологию, позволяющую проводить амплификацию ДНК или РНК без использования сложного термоциклирования. Данный метод основывается на действиях рекомбиназ, белков связывания одноцепочечных ДНК (SSB) и полимераз, что значительно упрощает процесс амплификации, снижая требования к лабораторному оборудованию и увеличивая доступность технологии для различных применений [13,19]. В последние годы RPA привлекла внимание научного сообщества как альтернатива традиционной полимеразной цепной реакции (ПЦР), благодаря своим уникальным преимуществам. Среди них — высокая скорость реакции, возможность работы в реальном времени и меньшие требования к подготовке проб и реагентам. Эти характеристики делают RPA привлекательным инструментом для диагностики инфекционных заболеваний, выявления генетических мутаций, а также в исследованиях по мониторингу устойчивости вирусов к антивирусной терапии [16]. Основные компоненты реакции Рекомбиназная полимеразная амплификация (RPA) представляет собой изотермическую методику амплификации нуклеиновых кислот, которая требует наличия нескольких ключевых компонентов, каждый из которых играет важную роль в успешной реакции. Основные компоненты реакции RPA включают рекомбиназы, белки связывания одноцепочечных ДНК (SSB), полимеразы и другие вспомогательные элементы, обеспечивающие эффективность и специфичность амплификации. Рекомбиназы Рекомбиназы — это ферменты, которые играют центральную роль в инициации амплификации в процессе RPA. Эти ферменты обладают способностью разрывать двуцепочечную ДНК и образовывать одноцепочечные участки, что необходимо для последующего связывания с праймерами и начала Выпуск журнала №-18 Часть–4_ Январь –2025 21 MODERN EDUCATION AND DEVELOPMENT репликации. В отличие от ПЦР, где температура изменяется для денатурации ДНК, в RPA рекомбиназы обеспечивают расплетение ДНК при постоянной температуре. Основными рекомбиназами, используемыми в RPA, являются T4 рекомбиназа и RecA, которые обеспечивают разрыв водородных связей между цепями ДНК, создавая одноцепочечные участки, на которые могут прикрепляться праймеры [22]. Белки связывания одноцепочечных ДНК (SSB) Белки связывания одноцепочечных ДНК (SSB) — это ферменты, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК, предотвращая их повторное образовывание в двуцепочечную структуру. В RPA белки SSB играют ключевую роль в стабилизации одноцепочечных ДНК, препятствуя их деградации и обеспечивая правильное направление амплификации. Белки SSB также способствуют оптимизации взаимодействия праймеров с одноцепочечными молекулами ДНК, что существенно увеличивает эффективность и специфичность реакции [17]. Полимеразы Полимеразы являются основным компонентом, отвечающим за синтез новой цепи ДНК. В RPA используются термостабильные полимеразы, такие как Bst полимераза, которая активно работает при температуре 37-42°C, что позволяет реакции протекать без необходимости в термоциклировании. Полимераза синтезирует новые цепи ДНК, начиная с праймеров, которые связываются с одноцепочечными участками ДНК. Важно, что полимеразы в RPA могут работать на одноцепочечных молекулах ДНК, что отличает этот метод от традиционной ПЦР, где используется двойная цепь для репликации [8]. Праймеры Праймеры являются короткими олигонуклеотидными последовательностями, которые связываются