The biotechnological cotton and a npt ii selectable marker gene

Аннотация

The article discusses the behavior of the selective marker gene npt II, providing resistance to kanamycin in the biotechnology population cotton variety Porloq-1 in connection with the experimenter is faced with when creating biotechnological plants. Keywords: biotechnological cotton plant, DNA, primers, PCR, selective marker genes (SMG), npt II, verification. Npt II ген будучи бактериальным по происхождению, был выделен из из транспозона Tn5 E.coli и кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу II (амино-гликозид-3’- фосфотрансферазу II, АРН(З’)II), активность которого придает ей признак устойчивости к родственным антибиотикам: канамицину, неомицину и гинетицину [1]. Данный ген активно используется в генной инженерии при создании векторных (генетических) конструкций для трансформации. Клетки, в геном которых включают этот ген, приобретая устойчивость, способны выживать при инкубации в канамициновой среде. В своем составе такие внехромосомные экспрессирующиеся (или челночные) векторы имеют сайты инициации репликации и обязательно селективный ген [2]. 260 Scientific research results in pandemic conditions (COVID-19) Непредсказуемые изменения в экспрессии перенесенных генов - одна из проблем, с которыми сталкивается экспериментатор при создании и исследовании трансгенных растений. Как выяснили исследователи, работавшие с трансформацией, в условиях стабильной экспрессии перенесенных генов их проявление среди потомков соответствовало доминантной мутации при полном доминировании и наследование подчинялось классическим законам Менделя. В случае нарушений экспрессии ими наблюдено как отклонения от ожидаемых расщеплений, так и полная потеря экспрессии перенесенных генов [3,4]. Описаны случаи нестабильной экспрессии чужеродных генов, где их проявление выражается в виде мозаицизма, как чередование участков растительных тканей с активным и неактивным трансгеном. Авторами изучалась стабильность экспрессии и наследования чужеродной ДНК в геноме трансгенных растений [5]. Проблема поведения селективного маркерного гена заинтересовала нас в связи с целью получить популяцию биобезопасных биотехнологических сортов – одной из актуальных сегодня тем, связанных с коммерческими культурами, особенно выходящими на мировой рынок. B нашу задачу входило выявить генотипы, не несущих ген канамицинустойчивости, у биотехнологических сортов хлопчатника, а также по мере возможности определить характер проявления селективного маркерного гена в поколениях хлопчатника сорта Порлок-1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования послужил хлопчатник серии Порлок-1, полученный техникой РНК-интерференции (PHYA1 RNAi). Для молекулярно-генетического скрининга были использованы следующие методы: - экстракция геномной ДНК из листьев хлопчатника методом СТАБ; - ПЦР (полимеразная цепная реакция); - гель-электрофорез (в 0,9% и 1,5 % агарозном геле). Очищенную растительную ДНК использовали в качестве матрицы при постановке ПЦР при инкубировании с сайт-специфическими праймерами. Были использованы праймеры для 35S, PDK и kan участков ДНК. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Результаты и обсуждение В результате ПЦР-скрининга на наличие в геноме векторной конструкции, выполненного парой праймеров 35S–F и PDK-R для хлопчатника сорта Порлок-1 были получены позитивные результаты. В ходе ПЦР были синтезированы продукты амплификации, что подтверждает присутствие в геноме растительных образцов векторной 261 Scientific research results in pandemic conditions (COVID-19) конструкции pHellsgate-8::PHYA1, или ее фрагмента. Затем, эти же образцы ДНК использовали в ПЦР с праймерной парой, специфичной для гена npt II. И на данном этапе мониторинга нам были интересны образцы, в которых реакция амплификации не состоялась. Имевшие негативные результаты амплификации с праймером на ген устойчивости к канамицину образцы были высеяны в грунт, и растительный материал был использован для мониторинга на наследование npt II. Таким образом, при скрининге геномов следующего года генерации из 214 растений хлопчатника семей № 21, № 23, № 35 и № 96, нами выявлено в общем счёте 134 образца, которые имели негативный ответ при постановке ПЦР с сайт-специфичными праймерами (kan) для гена, обеспечивающего устойчивость к канамицину (npt II). Как обсуждается в мировой литературе наследование привнесенных чужеродных генов, несмотря на то, что интегрированные в геном растения- реципиента фрагменты экзогенной ДНК (в нашем случае ген устойчивости к канамицину) становились его облигатным компонентом, сохранялись в последующих поколениях как неотъемлемая часть генома [6, 7].Однако к настоящему времени накоплено достаточно много примеров отклонений от менделевского наследования, обусловленных инактивированием гетерологичных генов[8]. Список литературы: 1. NarendraTuteja, Shiv Verma, SebastinRaveendar,RanjanSahoo, BheemaLingeshwara Reddy. Recent advances in development of marker- free transgenic plants:Regulation and biosafety concern// Journal of Biosciences