Клонирование, характеристика семейства генов MIC-3, определяющих устойчивость к патогенам хлопчатника (Gossypium spp.) и изучение их молекулярной эволюции, а также значение этих генов в биотехнологии

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. В связи с углублением глобализации на сегодняшний день усилена обеспокоенность в обеспечении биологической безопасности в мировом сельском хозяйстве и защите его от биотических (в виде фитопатогенов и вредителей) угроз. «Вред патогенных организмов в мировом сельском хозяйстве, оценен в 1,4 триллиона долларов. Это равно 5% глобальной валовой внутренней продукции»1. За годы независимости, в нашей стране ведутся широкомасштабные работы по повышению урожайности сельскохозяйственных культур и на сегодняшний день сельскохозяйственное производство составляет часть ежегодного экономического дохода страны. При этом осуществляются реформы в отрасли хлопководства и на основе проводимых программных мер получены определённые результаты, то есть, сокращены площади посевов хлопчатника и увеличена урожайность в среднем на 3-4 центнера. В процессе производства хлопка во всём мире разные патогены, такие как, вилт {Fusarium и Verticillium) и образующая галлы в корнях хлопчатника нематода (Meloidogyne incognita; RK.N) наносят большой вред урожаю. На нематоды приходится примерно 14% от всех мировых потерь, что выражается в сумме около S 100 млрд, долларов в год. «Значительные потери урожая хлопка в США за последние 10 лет из-за нематоды оцениваются примерно в 205 млн. долларов в год»2. С этой точки зрения, проблема борьбы с патогенами действительно является одной из важнейших задач мировых исследований на хлопчатнике, поэтому необходимо исследовать распространение болезней, а также развивать современные методы биотехнологии. Проведение исследований по изучению генетических основ борьбы с нематодой обосновываются следующим образом: необходимо выявление генов; придающих устойчивость к патогенам у хлопчатника; обоснование их структуры и состава в геноме хлопчатника; определение места расположения на хромосомах; исследование современных средств биотехнологии и геномики для получения устойчивых к патогенам линий. Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных Законом Республики Узбекистан №116-11 «О защите сельскохозяйственных растений от вредителей, болезней и сорняков» от 31 августа 2000 г., Постановлением Кабинета Министров Республики Узбекистан №148 «О мерах по совершенствованию структуры и повышению эффективности службы защиты растений» от 29 марта 2004 г., а также другими нормативно-правовыми документами, принятыми в данной сфере. Целью исследования является определение состава, структуры, расположения на хромосомах, а также механизмов дупликации и молекулярной эволюции MIC-3 генов у аллотетраплоидных и близких к их предкам диплоидных геномов хлопчатника. Научная новизна исследования заключается в том, что: впервые клонировано, секвенировано и охарактеризовано 169 индивидуальных членов, принадлежащих к супергенному семейству MIC-3 из 15 аллотетраплоидных и диплоидных генотипов; выявлено на основе анализа 169 MIC-3 генов, что в 15 генотипах хлопчатника имеются от 4 до 16 членов гена, которые делятся на 2-10 подсемейства. У всех видов Gossypium эти последовательности 169 MIC-3 генов были филогенетически разделены в общем количестве на 17 геном-специфичных подсемейств; доказано на основе анализа MIC-3 генов, выявленных у аллотетраплоидных видов, наличие 42 гаплотипных последовательностей, характерных для At- и Dt-геномов. Были созданы SNP маркеры, идентичные MIC-3 генам и на основе гаплотипных и подсемейственных групп, были определены 9 предполагаемых MIC-3 локусов в Аггеноме и 3 предполагаемых локуса в D,-геномах аллотетраплоидного хлопчатника; впервые созданы SNP маркеры, полученные из геном-специфичных MIC-3 генов, и выявлено, что MIC-3 гены расположены в кластерном виде на 4- и 19-гомеологичных хромосомах хлопчатника; впервые определены скорости нуклеотидных замен и процессы молекулярной эволюции MIC-3 генов у 15 тетраплоидных и диплоидных генотипов хлопчатника; выявлено на основе оценки среднего числа синонимичных (ds) и несинонимичных (сЫ) нуклеотидных замен для кодирующих последовательностей ДНК семейства MIC-3 генов, что несмотря на ранюю «совместную» эволюцию, семейство MIC-3 генов видов хлопчатника развивается путем эволюции «рождения и смерти» с изолирующим отбором в экзоне-1 и дивергентной селекцией в экзоне-2; впервые определена «амплификация гена» как возможный механизм сохранения всех дублирующих копий MIC-3 генов и появление новых функций генов в процессе защиты хлопчатника в рамках модели «исчезающей приманки»; доказано, что дупликации MIC-3 генов в различных геномах происходили с различными скоростями. Выявлено, что одна дупликация происходит один раз за ~1 миллион лет у аллотетраплоидов, один раз в ~2 миллиона лет у A/F геномов, и один раз в ~8 миллионов лет у D-геномов; по анализу экспрессии MIC-3 генов выявлена активность генов у генотипов, устойчивых к вилту Fusarium и Verticilliunv, впервые клонирована, секвенирована и охарактеризована межгенная спейсерная последовательность региона длиной в 2,5 kb, содержащая корень-специфичный промотор гена MIC-3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основе проведённых исследований по докторской диссертации на тему «Клонирование, характеристика семейства генов MIC-3, определяющих устойчивость к патогенам хлопчатника (Gossypium spp.) и изучение их молекулярной эволюции, а также значение этих генов в биотехнологии» представлены следующие выводы: 1. Впервые клонированы, секвенированы и выявлены положение, структура и содержание комплексного, крупного, специфичного только для хлопчатника, и экспрессируемого в корне семейства генов MIC-3 у аллотетраплоидных и диплоидных видов Gossypium. 2. 169 последовательностей геномной ДНК членов MIC-3 генов из 15 генотипов хлопчатника состоят из 4 до 16 членов гена из 2-10 подсемейств на каждый генотип/вид. 3. Все члены MIC-3 генов с использованием нуклеотидных полиморфизмов (SNP) и предполагаемых гаплотипов были филогенетически сгруппированы в 17 геномно специфических подсемейств. 4. Рекомендуется использование 42 гаплотипных последовательностей, полученных в результате анализа членов MIC-3 гена из аллотетраплоидного At- или Dt- геномов для определения специфичных для гена MIC-3 SNP полиморфизмов. 5. Впервые были разработаны MIC-3 геном-специфичные SNP маркеры и с использованием гаплотипических ассоциаций и экспериментов с длинными ПЦР была доказана кластерная локализация членов MIC-3 гена в гомеологичных сегментах хромосом 4 и 19 у G. hirsutum. 6. Впервые были определены скорости нуклеотидных замен и паттерны молекулярной эволюции мульти-генного семейства MIC-3 в 15 тетраплоидных и диплоидных генотипах хлопчатника. Оценкой среднего числа синонимичных (ds) и несинонимичных (dfj) нуклеотидных замен для кодирующих последовательностей ДНК семейства MIC-3 генов выявлены селекционные ограничения и молекулярная эволюция семейства этого гена в геноме хлопчатника. 7. Гены MIC-3 эволюцинируют в соответствии с моделью «рождения и смерти» под влиянием изолирующего отбора в экзоне-1 и дивергентной селекции в экзоне-2, хотя в начале молекулярной эволюции происходила стабилизирующая «совместная» эволюция. 8. Результаты также поясняют наличие «амплификации гена» как возможного механизма сохранения всех дублирующих копий MIC-3 генов и разработки новых функций генов в процессе защиты хлопчатника в рамках модели «исчезающей приманки». 9. Прохождение дупликации MIC-3 генов, один раз за ~1 миллион лет у аллотетраплоидных геномов, один раз в ~2 миллиона лет у А / F геномов, и один раз в ~8 миллиона лет у D-геномов, а также выявленная оценка времени и образец дупликации генов рекомендуется для понимания роли патоген-опосредованных процессов отбора в эволюции геномов хлопчатника. 10. Высокая экспрессия MIC-3 генов во время заражения патогенами Fusarium и Verticillium у устойчивых и неустойчивых генотипов сортов хлопчатника, ассоциируется сважным значением MIC-3 генов. 11. Впервые была клонирована и секвенирована нуклеотидная последовательность, а также охарактеризованы промоторные мотивы межгенного спейсерного региона длиной 2,5 kb, содержащего в себе MIC-3 промотор с сигнальной корень-специфичной последовательностью. 12. Созданы и трансформированы бинарные генетические векторы с минимальной нуклеотидной последовательностью промотора корень-спецефичного MIC-3 гена, содержащего синтетические РНК дуплексы, которые рекомендуются для биотехнологии растений.