Характеристика взаимосвязи структуры и функции в наноскопических белковых порах

Аннотация

Актуальность и востребованность темы диссертации. Одной из важнейших задач современной биофизики является изучение взаимосвязи структуры и функций ионных каналов, образованных белками. Ионные каналы являются наноскопическими порами, обладающими селективностью к ионам, способностью избирательно пропускать различные молекулы через мембрану или реагировать на них, изменяя свои свойства. Согласно последним исследованиям, именно ионные каналы являются сенсорами, которые помогают живым организмам измерять температуру, чувствовать запахи, вкус и свет. В тоже время, некоторые микроорганизмы (и в их числе высоко патогенные) продуцируют белки, способные самопроизвольно встраиваться в мембраны клеток-хозяев и формировать в них ионные каналы, через которые неконтролируемо выходят как ионы, так и водорастворимые вещества-метаболиты, что приводит к клеточной смерти. От этих белков-токсинов зависят не только клинические проявления болезней, но и состав среды, в которой существуют клетки и бактерии. В связи с этим нанопоры, образованные белками, привлекают пристальное внимание исследователей во всем мире как с точки зрения фундаментальных физиологических и биофизических принципов функционирования живых клеток, так и с практической стороны, так как существуют идеи по использованию их в качестве нано-секвенаторов, компонентов нано-фильтров, биосенсоров и других наноустройств. Во многих исследованиях, проводимых в мире, отмечается, что знание о структуре белковых нанопор и влиянии ее на свойства последних может помочь как в создании современных лекарств, так и в разработке наноустройств, используемых в новейших приборах. Наиболее перспективным ионным каналом в качестве основы нано приборов большинство исследователей считает а-гемолизин (а-ГЛ), продуцируемый бактериями Staphyloccus aureus, поэтому большое число работ посвящено исследованию свойств именно этого канала. Следует отметить, что способность а-ГЛ формировать водонаполненные трансмембранные поры в бислойных липидных мембранах была впервые обнаружена более 35 лет назад в Узбекистане. В свете выше сказанного тема диссертации является весьма актуальной и востребованной, так как данные о том, какие структурные особенности влияют на функционирование ионных каналов, как зависит их селективность от строения и аминокислотного состава, могут помочь в конструировании нанопор с заранее заданными свойствами. Данное диссертационное исследование в определенной степени служит выполнению задач, предусмотренных Совместным заявлением между Республикой Узбекистан и Японией, подписанным в феврале месяце 2011г. Целью исследования является определение структурнофункциональной взаимосвязи в ионных каналах, сформированных различными белками. Научная новизна диссертационного исследования заключается в следующем: впервые установлено, что методом асимметричной аппликации неэлектролитов можно измерить изменение радиуса поры вдоль оси ионных каналов; установлено, что радиус ионного канала VDAC изменяется при переходе из одного состояния проводимости в другое; установлено, что свойства ионных каналов зависят не только от знака заряда заряженных групп, распределенных внутри канала, но и от их местоположения вдоль оси канала; разработан новый метод определения стехиометрии олигомерных нанопор; установлено, что макси-анионный канал не относится к семейству VDAC белков; впервые доказано, что блокирование полианионами ионного канала зависит как от их размера, так и от концентрации двухвалентных катионов; установлено, что фиксированный на мембране потенциал вызывает эластическую деформацию а-ГЛ поры. выводы 1. Впервые модифицированным методом полимерного зондирования установлено, что: а) диаметры двух входов а-ГЛ канала близки друг к другу и равны 2,6/2,4 нм (цис/транс\ а-ГЛ канал имеет 2 узких участка: основное сужение диаметром 1,3 нм, расположенное примерно в центре канала и второе, диаметром 1,8 нм, расположенное ближе к цис входу в канал; б) диаметр цис входа VCC канала равен 1,9 нм, а транс входа 1,6 нм, внутри канала имеется одно сужение диаметром 1,2 нм; в) диаметры цис и транс входов ионного канала VDAC в высокопрово-дящем состоянии равны 2,0 и 4,0 нм, соответственно. При переходе в низкопроводящее состояние диаметры обоих входов уменьшаются и становятся равными 1,8 и 2,4 нм, соответственно. Суммарное уменьшение объема канала равно ~10 нм3 , что составляет около 40% от общего объема поры. 2. Детальное сравнение, при физиологических условиях, биофизических свойств макси-анионного канала и VDAC показало, что они формируются разными белками. 3. Впервые, методом цистеин-сканирующего мутагенеза, доказано, что добавление в структуру а-ГЛ канала дополнительных отрицательных зарядов изменяет его слабо анионную селективность на сильно катионную, а добавление положительных зарядов заметно увеличивает анионную селективность. Степень этих изменений зависит как от радиуса канала в точке добавления нового заряда (что преимущественно влияет на ионную избирательность), так и от расположения зарядов вдоль продольной оси канала (в основном изменяет вольт-амперную характеристику). Эти результаты демонстрируют, что суммарный заряд стенки поры несет ответственность за катион-анионную селективность а-ГЛ канала, а положение заряда у входа в пору является основным фактором, определяющим форму вольт-амперных кривых. 4. Разработан новый метод определения стехиометрии олигомерных ионных каналов, основанный только на электрофизиологических измерениях. С помощью него установлено, что а-ГЛ канал, сформированный в бислойной липидной мембране, является гептамером. 5. Установлено, что молекула полианиона входит в пору за счет электростатических сил и физически блокирует прохождение ионов. Вероятность блокирования а-ГЛ канала полианионами зависит: а) от присутствия и концентрации двухвалентных катионов, которые по эффективности располагаются в следующей последовательности: Zn2+ > Са2+ > Mg2+; б) от концентрации, молекулярной массы и структуры полианионов; эффективность влияния полианионов на канал коррелирует с их влиянием на ^-потенциал мембран; в) от стороны добавки полианионов, их добавка со стороны транс входа канала более эффективна, что связано с асимметричным строением а-ГЛ канала. 6. Впервые доказано, что фиксированный на мембране потенциал вызывает эластическую деформацию а-ГЛ канала, что объясняет остаточную асимметрию его вольт-амперной характеристики при высоких концентрациях соли и зависимость его блокировки комплексом 18-краун-6 с катионом калия от потенциала.